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ROS活性氧檢測技術

產品介紹

  ROS活性氧檢測技術
 ROS活性氧檢測技術利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧的檢測。DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細胞膜,進入細胞內后,可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜,從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF,檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。

ROS活性氧檢測技術

步驟

1.裝載探針

1.1 原位裝載探針(僅適用于貼壁細胞)

細胞準備:檢測前一天進行細胞鋪板,檢測時細胞匯合度達到50~70%

】:細胞狀態健康,且檢測時不會過度生長。

藥物誘導:去除細胞培養液,加入適量經合適的緩沖液或無血清培養基稀釋到工作濃度的藥物,于37細胞培養箱內避光孵育,具體誘導時間根據藥物本身特性,以及細胞類型來決定。

(可選)陽性對照:先用無血清培養基等稀釋陽性對照(Rosup, 100mM到常用工作濃度100μM,加入細胞,一般37避光孵育30min-4h可顯著看到活性氧水平提高,但依細胞類型會有比較明顯差異。【如,HeLa細胞孵育30minMRC5人胚胎成纖維細胞1.5h;】

探針準備:探針裝載前按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使其終濃度為10 μM

探針裝載:吸除誘導用藥物,加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜。如,對于6孔板通常不少于1000μl,對于96孔板通常不少于100μl37細胞培養箱內避光孵育30 min

細胞清洗:用無血清培養液洗滌細胞1~2次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA

1.2 收集細胞后裝載探針:適用于貼壁細胞和懸浮細胞。

細胞準備:按照標準方法培養細胞,檢測用細胞狀態健康。按照適當方法,清洗并收集足量的細胞。

藥物誘導:將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物,于37細胞培養箱內避光孵育,具體誘導時間根據藥物本身特性,以及細胞類型來決定。

(可選)陽性對照:先用無血清培養基等稀釋陽性對照(Rosup, 100mM到常用工作濃度100μM,加入細胞,一般37避光孵育30min-4h可顯著看到活性氧水平提高,但依細胞類型會有比較明顯差異。【如,HeLa細胞孵育30minMRC5人胚胎成纖維細胞1.5h;】

探針準備:探針裝載前,按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使其終濃度為10 μM

探針裝載去除細胞內藥物,離心收集細胞,加入適當稀釋好的探針,使其細胞密度為1.0×106~2.0×107。【】:細胞密度需根據后續的檢測體系,檢測方法,以及檢測總量來進行調整。如,對于流式分析,單管檢測內細胞數目不少于104,也不可多于106。每隔3-5min顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。

細胞清洗:用無血清細胞培養液洗滌細胞1~2,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA

2.檢測

原位裝載探針法:激光共聚焦顯微鏡直接觀察,或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

收集細胞后裝載探針:用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測,也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3.參數設置

使用488nm激發波長,525nm發射波長,實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似,可以用FITC的參數設置檢測DCF

ROS活性氧檢測技術

注意事項

1 探針裝載后,要洗凈殘余的未進入細胞內的探針,否則會導致背景較高。

2 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后,可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描,以確認探針的裝載情況是否良好。

3 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間(刺激時間除外),以減少各種可能的誤差。

4 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

目前,上海劍鈍生物科技有限公司主營實驗技術服務,動物模型構建,SCI服務,試劑盒,細胞株等,歡迎廣大科研者前來購買!

 

 

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