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病理實驗TUNEL檢測

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實驗原理

TUNEL法(terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法),也稱DNA斷裂的原位末端標記法。細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程,染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300 kb的大片段,然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下,在核小體單位之間被隨機切斷,形成180~200 bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端,再用辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素與衍生物上生物素結合(每個鏈霉親和素至少可以再結合3個生物素分子),最后用DAB、過氧化氫與辣根過氧化物酶發生氧化、環化反應,形成苯乙肼聚合物而呈現棕褐色,最終通過計數每張切片上不同視野中TUNEL陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發生情況。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3’-OH形成,很少能夠被染色。

實驗流程

(1)收集處理后的細胞或石蠟切片脫蠟至水。

    (2)過氧化氫甲醇中浸洗,抑制內源性過氧化氫酶。

    (3)用蛋白酶K室溫孵育15~30分鐘。

    (4)滴加TUNEL反應混合液(即配即用,4oC避光),孵育60分鐘,在熒光鏡下(綠色)分析結果。

    (5)加入轉化劑-POD,孵育20~30 min。

    (6)加入DAB底物溶液,孵育5~10 min。

    (7)中性樹膠或者甘油封片,光鏡下分析結果。

服務說明

(1)客戶提供:培養好的細胞以及所需藥品;或者提供石蠟標本

(2)公司提供:基本實驗步驟、圖片、數據分析結果、剩余藥品

     (3)實驗周期:1周左右,具體需要根據細胞生長情況及實驗內容而定。

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